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ELISA雙抗體夾心法關(guān)鍵步驟詳解
以下是本生技術(shù)小編對ELISA雙抗體夾心法的關(guān)鍵步驟詳解，結(jié)合操作要點和注意事項進行結(jié)構(gòu)化說明：
一、實驗原理概述?
雙抗體夾心法通過?兩種特異性抗體?(包被抗體和酶標抗體)結(jié)合抗原的不同表位，形成“夾心"結(jié)構(gòu)，最終通過酶催化底物顯色實現(xiàn)定量分析?。適用于檢測二價或以上大分子抗原?。
二、關(guān)鍵操作步驟?
1. ?包被抗體?
固相載體準備?：選擇聚苯乙烯酶標板(需驗證蛋白結(jié)合能力)，pH 9.0-9.6緩沖液稀釋抗體至濃度(需預(yù)實驗滴定)?。
包被條件?：4℃過夜孵育或37℃ 2小時，確保抗體充分結(jié)合?。
2. ?封閉未結(jié)合位點?
使用1-5% BSA或脫脂牛奶封閉，37℃孵育1小時，減少非特異性吸附?。
3. ?加樣與孵育?
標準品/樣本?：每孔加入100μL，37℃孵育1小時，確?？乖c包被抗體結(jié)合?。
洗滌?：PBS洗滌4-6次，每次30秒，拍干后保持孔內(nèi)濕潤?。
4. ?酶標抗體反應(yīng)?
加入生物素化抗體(與包被抗體結(jié)合不同抗原表位)，37℃孵育1小時?。
再次洗滌后，加入HRP-鏈霉親和素(若使用信號放大系統(tǒng))?。
5. ?顯色與終止?
加入TMB底物，避光孵育15-30分鐘，觀察梯度顯色?。
加入2Mliusuan終止反應(yīng)，藍色立轉(zhuǎn)黃色?。
三、注意事項?
抗體配對?：包被抗體與酶標抗體需識別抗原不同表位，避免交叉反應(yīng)?。
樣本處理?：避免溶血或纖維蛋白干擾，離心去除顆粒物?。
洗滌控制?：推薦自動化洗板機(350μL/孔，震板5秒)，減少背景噪聲?。
通過規(guī)范操作可顯著提高實驗重復(fù)性，避免鉤狀效應(yīng)(高濃度抗原導(dǎo)致假陰性)?。
注：以上資料僅供參考，如需進一步了解產(chǎn)品詳情，可參考品牌供應(yīng)商或技術(shù)老師。
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