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　　實驗分享 | 競爭法ELISA實驗操作指南

　　一、標準品稀釋及樣品準備

　　樣本4℃，1000Xg 5min

　　標準品4℃，10000Xg 1min

　　1mL稀釋液溶解標準品，靜置1-2min，每管加入500μL標準品&樣品稀釋液，靜置后標準品混勻，將液體離心至底部(800Xg 1min)

　　取同體積標準品原液稀釋，渦旋混勻，依次倍比稀釋標準品，最后一管為空白

　　二、生物素化抗體工作液制備

　　取5940μL生物素化抗體稀釋液，加入60μL濃縮液，稀釋100倍后，備用

　　顛倒混勻20次，備用

　　三、標準品及樣本、檢測抗體點樣

　　由低到高濃度，懸空加入，每孔加入50μL，處理后的樣品上清溶液，懸空，每孔50μL，生物素化抗體工作液，懸空加入，每孔50μL，腹膜后，標記簡稱。

　　提前預(yù)熱，注意溫度：37℃孵育45min，1*洗液配制，取288mL雙蒸水，取25*濃縮洗滌液12mL，加入燒杯，磁力攪拌器混勻5-10min。

　　四、HRP酶結(jié)合物工作液制備

　　取11880μLHRP酶結(jié)合物稀釋液，加入120μL濃縮液，稀釋100倍后，備用。

　　顛倒混勻20次，備用。

　　平衡取出酶標板，勿觸摸板條底部。輕撕覆膜，避免液體濺出。參數(shù)設(shè)定(洗滌次數(shù)3次、洗板條數(shù)12條、洗滌液量350μL/孔、震板5s)

　　拍干液體，更換吸水紙

　　懸空垂直加入HRP酶結(jié)合物工作液，每孔100μL，腹膜后，標記。37℃孵育30min，平衡取出酶標板，勿觸摸板條底部，洗滌(參數(shù)設(shè)定：洗滌次數(shù)5次、洗板條數(shù)12條、洗滌液量350μL/孔、震板5s)

　　拍干液體，更換吸水紙

　　五、顯色

　　懸空垂直加入底物溶液，每孔90μL，腹膜后，標記，37℃孵育15-30min，平衡取出酶標板，切勿觸摸板條底部，顯色后四孔出現(xiàn)明顯藍色梯度。

　　六、終止反應(yīng)

　　懸空垂直加入終止液，每孔50μL，加入終止液時可看到藍色立轉(zhuǎn)為黃色。

　　七、數(shù)據(jù)處理

　　輕輕擦拭板底，放入酶標儀中，上機操作。

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